東京工業大学 科学技術創成研究院 化学生命科学研究所の前田海成 助教、東京農業大学大学院バイオサイエンス専攻、坂巻裕 博士課程学生（日本学術振興会特別研究員DC2）、小野美月 修士課程学生、生命科学部バイオサイエンス学科、重成希 学部学生（研究当時）、荷村（松根）かおり 博士研究員、千葉櫻拓 教授、渡辺智 准教授、同分子生命化学科、下村健司 准教授らの研究グループは、光合成微生物であるシアノバクテリアのプラスミド複製に関わるタンパク質CyRepA2を同定し、CyRepA2を用いたベクターが幅広いシアノバクテリア種で利用できることを発見しました。さらにこのベクターを用いてシアノバクテリアによる揮発性テルペノイドの生産系を構築しました。

CO₂を固定しつつ炭素化合物を合成するシアノバクテリアはカーボンニュートラルな次世代の有用物質生産ホストとして期待されています。これまで産業微生物では遺伝子改変により目的に応じた形質を付与することで、人工代謝経路や所望の形質の導入が行われてきましたが、シアノバクテリアでは利用可能な遺伝子工学ツールが限られているのが現状でした。特にシアノバクテリアはベクターとして利用可能なプラスミドについての情報が乏しく、その複製機構は、ほとんどわかっていませんでした。

研究グループは、シアノバクテリアのモデル生物としてよく利用されているSynechocystis sp. PCC 6803 (以下PCC 6803) を材料として、プラスミド複製に関わる領域の網羅的スクリーニングを実施し、PCC 6803のプラスミドpCC5.2内に高い複製活性を持つ領域を見つけました（図1）。この領域に含まれる機能未同定のタンパク質はPCC 6803だけでなく幅広いシアノバクテリアに保存されていたことからCyRepA2 (Cyanobacterial Rep protein A) と命名し、これを用いて発現ベクターpYSを構築しました（論文1）。GFPをpYSに搭載し、宿主域と発現活性について調べたところ、pYSはPCC 6803やSynechococcus elongatus PCC 7942（以下PCC 7942）のみならず、 海洋性シアノバクテリアであるSynechococcus sp. PCC 7002や系状性シアノバクテリアであるAnabaena sp. PCC 7120においても安定的に保持されることが示されました（図2）。特にPCC 7942ではGFPを指標とした場合、染色体での発現系に比べ10倍以上の高い発現量が確認されました。

続いて、研究グループは物質生産研究におけるpYSの有用性を実証しました。植物の葉緑体の祖先生物であるシアノバクテリアは葉緑体と類似した代謝機能を有します。この点に着目し、植物の生産するテルペノイドを生産のターゲットとしました。1,8-シネオールはユーカリなどに含まれる揮発性のテルペノイドで医薬品やアロマ成分として利用されています。通常、植物では二つの酵素の反応によって1,8-シネオールが生産されますが、研究グループは単独で1,8-シネオールを合成できる放線菌の酵素CnsAに着目しました。cnsA遺伝子をシアノバクテリア用に人工合成し、これをpYSへとクローニングしたのちにシアノバクテリアPCC 7942へと導入しました。これによりPCC 7942においてCnsAを誘導発現させることで、1,8-シネオールの生産に成功しました（図3）。

CO₂削減と物質生産を両立させるシアノバクテリアを用いたものづくりは時代のニーズに合った技術です。pYSは幅広いシアノバクテリア種で利用可能であることがわかっており、シアノバクテリアの産業利用を加速させる新たな遺伝子工学ツールとして期待ができます。また本研究はシアノバクテリアの基礎研究の発展にも大きく貢献できます。シアノバクテリアではプラスミドの複製機構についても情報が乏しく、CyRepA2の発見がDNA複製やゲノム科学分野に新たな知見をもたらすと期待できます。

現状において、1,8-シネオールの生産量は従属栄養細菌を用いた生産系には及びません。しかし、テルペノイド代謝経路の最適化や回収方法を検討することで1,8-シネオールの増産や持続的な生産が可能になると考えられます。植物では希少価値の高いテルペノイドがいくつも見つかっています。シアノバクテリアは強いテルペノイド代謝経路を有しているため、希少テルペノイドの生産ホストとして有用であると考えられます。

本研究は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業 先端的低炭素化技術開発（ALCA）（JPMJAL1608）、JSPS科研費（20K05793、JP22J13447）および生物資源ゲノムセンターの共同利用?共同研究拠点事業の支援を受けて実施されました。